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一抗背景黑前沿信息_一抗背景黑是什么(2024年12月实时热点)

内容来源：蜂巢动画所属栏目：教程更新日期：2024-11-30

一抗背景黑

𐟔젗B实验常见问题解答集锦一. 𐟏… 电泳常见问题电泳条带扭曲：可能是电泳槽内部电泳液未加满或漏液，及时加满电泳液可使条带变直。电泳条带拖尾：样本溶解不均匀可能导致拖尾，确保样本溶解后再上样。电泳条带扩散：加样量过多会导致条带扩散，适当减少上样量可改善。溴酚蓝呈笑脸状：泳道底部中间高、两边低，可能是制胶试剂温度高或制胶后未及时保湿，导致胶不均匀冷切。可降低电压，缓慢电泳，或在冰浴条件下进行。二. 𐟔„ 电转常见问题膜转反：注意“黑胶红膜”原则，即转膜夹黑色部分对应胶，红色部分对应膜。转膜夹放置错误：确保转膜夹红色对红色，黑色对黑色。背景有气泡：转膜过程中气泡会导致不均匀的白色斑点，转膜时要仔细检查，避免气泡产生。三. 𐟔’ 封闭常见问题背景脏：封闭不充分可能导致背景脏，可延长封闭时间或更换封闭液。条带有黑色斑点：封闭液未完全溶解会导致黑色斑点，封闭液需充分摇匀。条带信号弱：过度封闭可能使信号弱，可适当降低封闭液浓度或更换封闭液。封闭时间过长：封闭时间过长可能影响抗原抗体结合，建议封闭时间为常温1-2小时，并减少封闭液中的蛋白浓度。膜上有黑点和黑斑：可能是膜上其他部位与一抗或二抗非特异性结合，封闭液需完全溶解并混匀，选择纯牛奶作为封闭液，封闭后彻底清洗。非均一性背景：膜可能过干导致非均一性背景，操作过程中注意保持膜湿润。非特异性条带：封闭不彻底可能导致非特异性条带，重新调整封闭条件，选择适合的封闭液，适当提高封闭物浓度，延长封闭时间。抗体与封闭试剂反应：使用前过滤封闭试剂可避免此问题。四. 𐟐 孵一抗二抗常见问题蛋白条带信号弱：抗体孵育不完全可能导致信号弱，增加抗体浓度和延长孵育时间可改善。背景有白色斑点：抗体孵育不均匀可能导致不均匀的白色斑点，孵育抗体时使用摇床可避免此问题。

玄学WB实验的那些坑，你踩过吗？𐟘… 做WB实验的小伙伴们，你们是不是也遇到过一些让人头疼的问题？今天就来聊聊那些玄学WB实验中需要注意的事项，希望能帮到你们！背景脏乱差 𐟘– 有时候你会发现背景脏得不行，甚至有不规则的成片。这可能是因为封闭不充分。解决办法其实很简单：要么延长封闭时间，要么换换封闭液。相信我，这招绝对有效！条带上有黑色斑点 𐟤” 如果你发现条带上出现了黑色斑点，那很可能是封闭液没完全溶解。记得每次用封闭液之前都要充分摇匀哦！不然的话，实验结果可是会大打折扣的。条带信号太弱 𐟒” 有时候条带信号太弱，可能是因为过度封闭。这时候你可以试试降低封闭液的浓度，或者干脆换一种封闭液。毕竟，适度才是王道嘛！封闭时间太长 ⏳ 封闭时间太长也会影响抗原抗体的结合。一般来说，封闭时间在常温下1-2小时就够了。而且，封闭液中的蛋白浓度也要控制好，别太高也别太低。膜上出现黑点和黑斑 𐟖䊥悦žœ你发现膜上有黑点和黑斑，那很可能是膜上其他部位与一抗或者二抗发生了非特异性结合。这时候，封闭液一定要完全溶解并混匀，封闭牛奶也要选纯的。封闭结束后，记得好好洗干净哦！希望这些小贴士能帮到你们，让你们的WB实验更加顺利！如果还有什么问题，欢迎留言讨论哦！𐟒쀀

WB实验全攻略：从零开始到成功曝光在WB实验领域摸爬滚打了四年，我积累了不少心得。从细胞培养的第一步到最后的化学发光成像，每一个细节都至关重要。两天的辛勤工作，往往在曝光的瞬间决定成败。下面是我总结的一些关键步骤，希望能帮到你们。电转：关键的一步 𐟔犦🀦𔻐VDF膜：PVDF膜需要在甲醇和4度中激活30分钟。电泳后处理：电泳结束后，取出胶板，短玻璃板朝上放置。揭开短玻璃板后切除多余的胶，在水中将胶从长玻璃板上取下。转膜：在电转液中，转膜夹黑色面朝下，依次放置石棉网-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-石棉网，夹紧转膜夹，注意PVDF膜要与胶贴合，排走气泡。调整转膜夹黑色界面转向转膜槽负极，白色面朝向转膜槽正极。灌满电转液后，用200mA恒定电流转膜120分钟（具体条件自行探索），转膜槽外周装满冰块。封闭：去除背景的关键 𐟐„ 转移膜：将膜取出后，应观察到marker完全从胶转移至膜上。清洗：用TBST快速清洗掉膜上残留的电转液。封闭：将PVDF膜浸泡在5%封闭牛奶中，缓慢摇荡，室温孵育1小时。抗体孵育和化学发光成像：让蛋白可视化 𐟌Ÿ 一抗孵育：封闭结束后，用1㗔BST缓冲液洗掉多余的牛奶，洗膜每次5分钟，共3次。一抗使用一抗稀释液或TBST按照1：5000稀释（具体条件自行摸索），然后将膜浸泡在一抗中，于4℃冰箱中摇床孵育过夜。二抗孵育：一抗孵育后并回收，加入1㗔BST缓冲液放置于摇床上快摇5分钟，共3次。使用5%脱脂牛奶按照1:1000稀释二抗，室温慢摇1小时。化学发光成像：二抗孵育完毕后，回收二抗，1㗔BST快洗5分钟，共3次。洗膜结束后，将发光液敷在膜上，通过化学发光成像仪曝光，采集并使用ImageJ分析灰度。希望这些步骤能帮到你们，祝大家实验顺利！𐟒ꀀ

𐟧쥰分子蛋白WB技巧大揭秘𐟔 WB实验中，小分子蛋白的条带显示不出来？别急着更换一抗，先试试优化实验条件吧！这里有一些实用的技巧分享给大家。 𐟔砧”𕦳𓦝᤻𖯼š 80v跑开marker，120v跑到底，最近尝试80v跑到底，观察结果是否可以进一步优化。 𐟔„ 转膜条件：对于27kDa的蛋白，100mA，1小时的转膜条件是不错的选择。膜不糊，蛋白和marker也不会变形。大分子蛋白可以略过此步骤。 𐟥› 封闭条件：使用5%脱脂奶粉(TBST)封闭3小时，奶粉一定要充分溶解，否则显影时膜上会出现黑点点。 𐟚🠦𔗨†œ步骤：封闭后用TBST洗膜，每次10分钟，共3次；一抗后每次15分钟，共3次；二抗后每次10分钟，共3次。洗膜不能偷懒哦！ 𐟧젦Š—体浓度：一抗1:1000，二抗1:10000（四个零哦）。 𐟧ꠦŠ—体稀释试剂：脱脂奶粉和专用抗体稀释液在我这个蛋白里区别不大，但另一个53kDa的蛋白发现脱脂奶粉会更优秀一丢丢。 ⚠️ 避坑提示：电泳：参考nb老师的跑胶大法，电泳洗过的蛋白跑出来的条带会很干净哦。但我新换的电泳仪低于40v根本不工作，所以只能退而求其次老实的80v了。转膜：恒流恒流恒流！千万不要跟风，别人350mA，300mA跑一小时，一个半小时，跑完有没有发现条带不见了，背景一曝光一片黑，膜胡掉了，连好好的marker都变歪了。此时此刻说明你得电流过大了，可以选择降低电流。有的人还说，根据蛋白量大小的二倍去设置时间和转膜电流，亲测不好使。小分子的可以选择100mA，1小时；大分子的可以尝试200mA或260mA，1小时。特别特殊的蛋白除外，特殊蛋白是真的需要花时间去摸索条件。洗膜：碧云天的一抗二抗洗膜液，不喜欢不喜欢！10min蛋白洗光光，5min蛋白洗掉不少，3min抗体没洗掉，marker还变色了，很是神奇。看来还是裁膜更好。希望这些技巧能帮助你在WB实验中取得更好的结果！

abmart抗体，实验神器！最近用了abmart的MAPK通路抗体，真心觉得不错，比CST的还要好用呢！分享几款我常用的抗体：经典一抗 - ERK1/2 Antibody（货号T40071）这个抗体特别好用，信号特别强，做实验的时候省了不少心。经典一抗 - Phospho-Erk1(T202/Y204)+Erk2(T185/Y187) Antibody（货号T40072）这个抗体能同时检测Erk1和Erk2的磷酸化，效率超高。经典一抗 - p38 MAPK Antibody（货号T55600） p38的抗体，信号清晰，背景干净，推荐！经典一抗 - JNK1/2/3 Antibody（货号T40073） JNK的抗体，特异性好，适合各种实验需求。经典一抗 - p-JNK1/2/3 (Thr183+Tyr185) pAb（货号T40074）这个磷酸化特异性的JNK抗体，效果非常棒，强烈推荐！经典一抗 - Phospho-p38 MAPK (Thr180/Tyr182) Antibody（货号T90391） p38磷酸化特异性的抗体，信号非常清晰，背景干净。总的来说，abmart的这些抗体真的让我省了不少心，实验结果也很满意。如果你也在找好的MAPK通路抗体，不妨试试这些吧！𐟒ꀀ

Western Blot心得：血泪教训大家好，今天我想和大家分享一些关于Western Blot的实验心得，真的是血泪教训啊！希望对大家有所帮助。电泳电压的选择 𐟔‹ 首先，电泳电压的选择很重要。我一般先用60V跑到上下胶的交界处，然后再用130V跑到底。这个方法感觉还挺靠谱的，大家可以试试。切胶转膜：小心点，别翻车 𐟚— 这一步我可是吃了大亏，被嘲笑了两次。为了节省时间，我会在marker还有大概1cm跑到底的时候切膜。大概根据marker的宽度和长度，在膜上用铅笔画出来，然后把膜剪出来。记得标上数字或者其他的符号，便于你对应你的条带是内参还是目标蛋白。电泳结束之后，就切胶，这一步没有技术含量，但一定要小心，不要把胶弄坏了。然后转膜，提前配好转膜液。转膜的板子放置位置一定要正确：黑胶白膜！一定不要放反，否则你的实验也就止步于此了！按位置放好之后做成一个“三明治”的结构，放置转膜的槽里。这里也要画重点：黑色的板子要对黑色的槽那一面，槽子有两个电极，也是要黑色对黑色，红色对红色！一定不能放反，否则实验就结束了！还有一个重点：水槽里转膜液一定要和外面盆子里的液体（一般是冰块或者冰水）有液面差，不然你的蛋白会跑到外面去！我就吃了这些亏𐟘�˜�쨆œ电流300mA，90min. 洗膜与封闭：细节决定成败 𐟧𜰟囊洗膜用TBST洗5次，每次6min。封闭我用过快速封闭液和牛奶，个人觉得牛奶效果更好点，但牛奶封闭不适用某些磷酸化的抗体，这个需要自己判断。牛奶我封闭一个半小时，快速封闭液半个小时，但具体的时间需要自己摸索，真的很难𐟘🣀‚封闭结束之后洗膜：我喜欢短时间多次洗的方式，觉得比3次10min会洗的更干净。我一般洗6次，每次5min，这样条带背景会干净很多！敷一抗与洗条带：耐心与恒心 𐟕𐯸 敷一抗时，我们用过4℃的摇床敷过夜，也在4℃冰箱里直接敷过夜过。效果当然是摇床敷过夜抗体会敷的更均匀，显色更好。第二天我会把条带在室温复温半个小时，效果更好。洗条带也是6次，每次5min。敷二抗与显影：最后的冲刺 𐟏 敷二抗时，室温，摇床避光敷2个小时。没有特别的。显影的时候，建议不要省显影剂，尽量铺均匀，这样显色也会均匀很多。最后的祝愿 𐟌Ÿ 希望我们都能跑出好看的Western Blot结果！祝大家实验顺利！

免疫组化实验全解，必看！ 𐟔젦Š€术原理：免疫组化是利用免疫学基本原理——抗原抗体反应，通过化学反应使标记抗体的显色剂（如荧光素、酶、金属离子、同位素）显色，从而确定组织细胞内的抗原（多肽和蛋白质），进行定位、定性和定量研究。 𐟓 实验步骤：切片脱蜡至水抗原修复 3%双氧水处理，画圈，血清封闭一抗4Ⰳ过夜孵育二抗室温孵育显色苏木素染核，脱水，透明封片，显微镜观察 𐟓栩€样运输要求：石蜡切片制片：组织取样后应立即放入固定液中，避免冻存。冰冻切片制片：应取用新鲜组织，以免抗原丢失。组织蜡块可长期保存，但石蜡切片理论上不超过半年，冰冻切片不超过3个月。 𐟓 注意事项：苏木素复染时间需摸索，尤其是阳性染色在细胞核上。 DAB显色时间需优化，镜下观察达到阳性染色明显但背景不深。抗体孵育时间和浓度需摸索，尤其一抗孵育最好在4度过夜。切片脱蜡和水化要充分，加反应液时要覆盖组织充分，每次加液前甩干洗涤液，防止干片。用组化笔画圈时尽量画大一点，否则墨水排斥液体，引起片周边干片。 𐟤” 常见问题：片子着色不均匀？脱蜡不充分：可以60℃烤20分钟，立即放入新鲜的xylene。水化不全：应经常配制新鲜的梯度乙醇。抗体没混匀：用移液器充分混匀一抗/二抗等试剂。抗体孵育时，切片放倾斜。抗体孵育后PBS冲洗不充分。制片厚薄不均匀：染片盒不平，切片倾斜。 𐟌᯸ 一抗从4℃拿出后，为什么有人说要37℃复温？防止切片从4℃直接放入PBS易脱片。使抗原抗体结合更稳定。一般不需要，但对表达较弱的抗原可能有用。4℃和37℃时分子运动方式不同，前者分子碰撞机率和运动速度小于后者，后者结合更快，但敏感性也提高了并易造成非特异染色。 𐟌미 切片染色后背景太深，不易区分特异性与非特异性着色？抗体孵育时间过长、抗体浓度高易增加背景着色。这可通过缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制。一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体。

𐟌€解决WB条状高背景的探索之旅𐟔 家人们，有没有遇到过这种情况？转膜后丽春红染色看起来没问题，但增加洗膜时间后背景依旧。封闭或抗体不均匀？（虽然看起来都浸没了）如果膜再生，重新封闭孵抗体还有希望吗？𐟘⊊6月17日更新：有趣的是，因为怀疑是非特异结合，所以没有膜再生，直接用TBST洗了一下午，周末又孵育了新配的一抗。第一次显色效果如P2所示，条带还是挺漂亮的。担心显色液不均匀，又曝光了一次，结果出现了类似的高背景。目前考虑：1、一抗效价降低导致与蛋白结合不足；2、膜本身存在问题，可能是干燥或封闭不足（转膜时师妹帮忙操作了一部分，具体不详）。今天进行了膜再生，准备孵另一个抗体试试，期待后续结果。𐟔

WB实验封闭液：速封VS脱脂在进行Western Blot（WB）实验时，封闭液的选择至关重要，它能够影响实验的最终结果。封闭液的主要作用包括：阻止非特异性结合最小化非特异性背景保持膜湿润如果封闭效果不佳，会增加背景信号，降低目标蛋白的信号强度，从而影响实验效果。以下是两种常见的封闭液：脱脂奶粉和BSA，以及它们各自的优缺点。脱脂奶粉 𐟥› 优点：价格便宜，容易购买。缺点：成分复杂，适用范围有限。温度过高时容易变质，产生异味或絮状沉淀。封闭时间长，通常需要在室温下放置2小时，或者4℃过夜。含有少量生物素和碱性磷酸酶残留，可能导致背景增加。自身含有生物素，不能用于生物素标记的抗体系统。 BSA 𐟧스𜘧‚𙯼š成分单一，适用于大多数情况。缺点：封闭时间长，通常需要在室温下放置2小时，或者4℃过夜。用量大，成本较高。 BSA有很强的免疫原性，可能导致产生针对BSA的抗体，从而产生交叉反应。动物源，可能含有杂质，与一抗、二抗非特异性结合。新型快速封闭液 𐟚€ 随着科技的进步，现在有一种新型的封闭液可以替代脱脂奶粉和BSA，它具有以下优点：封闭时间短，仅需10分钟。兼容室温、低温、37℃等多种温度。成分单一明确，无动物源，不与抗体非特异性结合。能够有效降低背景，提高信噪比。封闭效果优于传统封闭液及其他同类封闭液。选择合适的封闭液能够确保WB实验的顺利进行，并获得高质量的实验结果。

WB操作指南：减少99%弯路的实用技巧 ### 转膜注意事项 𐟓Œ 大分子量蛋白：在转膜缓冲液中加入0.1%的SDS。将甲醇浓度降至10%或更低，使用4℃湿转过夜代替半干法转膜。增加转膜时间和电流/电压。小分子量蛋白：去除缓冲液中的SDS。保持甲醇浓度在20%。使用小孔径的膜。降低转膜时间和电流/电压。膜的方向确定 𐟧튨𝬧绥Ž剪角做标记，分清正反面。用铅笔做记号或电泳时Marker上成非对称的。转膜后背景高 𐟌미 选择NC膜。转膜时污染 𐟚늩🥅手指触碰膜，可以用镊子取膜。油脂和蛋白质会弄脏膜。滤纸的大小 𐟓 确保滤纸和膜的大小与胶一致。使用半干法转膜时，过多的部分会阻碍电流穿过膜。膜封闭 𐟔’ 封闭目的：转印结束后，必须将对印迹膜上未被占据的蛋白结合位点封闭掉以防止非特异性探针结合。如果没能将膜上位点全部封闭，会导致印迹膜出现较高的背景。脱脂奶粉：通常使用浓度为2.5%~5%。不能用于磷酸化蛋白，因为脱脂奶粉中的酪蛋白本身是一种磷酸化蛋白，会结合磷酸化特异性抗体而易产生高背景。牛血清蛋白（BSA）：通常使用浓度为2%~5%。某些抗体用BSA封闭会产生比脱脂牛奶更强的信号。抗体孵育 𐟧슦Š—体孵育原理：一抗识别膜上蛋白或修饰性抗原表位，二抗识别一抗恒定区从而与一抗结合，最终通过二抗携带的荧光或酶显色信号，达到对样本中目的蛋白进行检测的目的。抗体选择：根据官网了解该抗体发表文献的数量，选择发表文献较多的货号。根据实验动物的种属性选择合适的抗体，比如小鼠的一抗需要选择抗小鼠的。根据实验类型选择厂家验证过的抗体，尽可能选择能够满足多种类型实验的抗体。抗体偶联物：标签结合在抗体上使抗体的结合可见，选择标签抗体以检测方法的为依据进行选择。一般推荐使用HRP标记二抗，不建议使用碱性磷酸酶（AP）标记二抗，因其不够灵敏。在二抗种类的选择上，二抗应来源于产生一抗的物种。抗体孵育、洗涤注意事项 𐟧𜊤𘀦Š—孵育、洗涤：将一抗用Western Antibody Dilution Buffer按照合适比例进行稀释。封闭结束后，将稀释好的一抗工作液倒入孵育槽中，室温2h或4Ⰳ过夜。一抗孵育结束后，加入TBST Buffer洗涤。

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