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wb背景较高权威发布_wb背景高(2024年12月精准访谈)

内容来源：蜂巢动画所属栏目：观点更新日期：2024-12-01

wb背景较高

WB实验背景脏？6个步骤教你解决！在进行WB（Western Blot）实验时，背景脏是一个常见的问题。𐟘“ 明明跑出了想要的趋势，但背景却一团糟，这该如何解决呢？其实，背景脏并不一定是因为仪器不干净，也可能是蛋白降解或者实验条件不合适导致的。以下是一些可能出错的关键步骤，以及如何避免这些问题的建议：实验准备首先，确保所有用于提取蛋白的研磨器材、制胶的玻璃板和梳子都清洗干净。如果这些器材长时间不使用，建议在使用前再次清洗，以杜绝污染。提取蛋白选择合适的蛋白裂解液，这样可以去除一些干扰因素，如核酸、多糖和脂类等。蛋白在测量浓度后应变性分装保存，避免反复冻融导致蛋白降解。此外，确保Loading buffer在保质期内，并在加入蛋白后充分混匀，再煮沸变性。制胶在制胶过程中，玻璃板夹紧后，有些人习惯性加水测试是否漏胶。建议用蒸馏水而不是自来水测试，测试结束后要将玻璃板之间的水倒干净，用滤纸吸干残留的水。灌胶前要将配好的试剂充分混匀，灌胶时要掌握好速度，缓慢加入，避免产生气泡。灌注好分离胶后，缓缓加入无水乙醇封胶，速度一定要慢，防止胶面被冲变形。温度较高时，30分钟左右就会凝固；冬天气温较低可能需要较长时间。若分离胶液面不平，会影响后期蛋白电泳的效果。转膜转膜前需在转膜板两侧各放置3至4张滤纸（两侧数量相同）。切记不要用手直接接触PVDF膜和滤纸，手上的油脂会对其造成污染，务必佩戴干净的手套，全程尽量使用镊子夹取。转膜过程中海绵-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-海绵每一层的气泡要排空。转膜时要使整个电转仪置于冰水混合物中，常用220V或者其他高电压进行。机器温度升高会使蛋白降解，导致转膜后条带跑糊，发光后条带和背景也会脏得一塌糊涂。孵育抗体孵育一抗的时间大多选择4℃过夜，也可以室温封闭2小时。4℃过夜效果会比室温好。二抗孵育的时间不宜过长，一般是室温下摇床孵育1到2小时。抗体孵育完成后要清洗干净，特别是二抗孵育完成后，否则可能导致显影结果出现高背景。发光液配置大部分实验室使用的ECL发光液，A液和B液按照1:1的比例配置。发光液要求现用现配，每次根据使用量合理配置用液量。发光液配置时间过长同样会引起发光效果不好，背景脏或者漆黑一片。通过以上步骤，可以有效解决WB实验背景脏的问题，让你的实验结果更加清晰准确！𐟒ꀀ

WB操作指南：减少99%弯路的实用技巧 ### 转膜注意事项 𐟓Œ 大分子量蛋白：在转膜缓冲液中加入0.1%的SDS。将甲醇浓度降至10%或更低，使用4℃湿转过夜代替半干法转膜。增加转膜时间和电流/电压。小分子量蛋白：去除缓冲液中的SDS。保持甲醇浓度在20%。使用小孔径的膜。降低转膜时间和电流/电压。膜的方向确定 𐟧튨𝬧绥Ž剪角做标记，分清正反面。用铅笔做记号或电泳时Marker上成非对称的。转膜后背景高 𐟌미 选择NC膜。转膜时污染 𐟚늩🥅手指触碰膜，可以用镊子取膜。油脂和蛋白质会弄脏膜。滤纸的大小 𐟓 确保滤纸和膜的大小与胶一致。使用半干法转膜时，过多的部分会阻碍电流穿过膜。膜封闭 𐟔’ 封闭目的：转印结束后，必须将对印迹膜上未被占据的蛋白结合位点封闭掉以防止非特异性探针结合。如果没能将膜上位点全部封闭，会导致印迹膜出现较高的背景。脱脂奶粉：通常使用浓度为2.5%~5%。不能用于磷酸化蛋白，因为脱脂奶粉中的酪蛋白本身是一种磷酸化蛋白，会结合磷酸化特异性抗体而易产生高背景。牛血清蛋白（BSA）：通常使用浓度为2%~5%。某些抗体用BSA封闭会产生比脱脂牛奶更强的信号。抗体孵育 𐟧슦Š—体孵育原理：一抗识别膜上蛋白或修饰性抗原表位，二抗识别一抗恒定区从而与一抗结合，最终通过二抗携带的荧光或酶显色信号，达到对样本中目的蛋白进行检测的目的。抗体选择：根据官网了解该抗体发表文献的数量，选择发表文献较多的货号。根据实验动物的种属性选择合适的抗体，比如小鼠的一抗需要选择抗小鼠的。根据实验类型选择厂家验证过的抗体，尽可能选择能够满足多种类型实验的抗体。抗体偶联物：标签结合在抗体上使抗体的结合可见，选择标签抗体以检测方法的为依据进行选择。一般推荐使用HRP标记二抗，不建议使用碱性磷酸酶（AP）标记二抗，因其不够灵敏。在二抗种类的选择上，二抗应来源于产生一抗的物种。抗体孵育、洗涤注意事项 𐟧𜊤𘀦Š—孵育、洗涤：将一抗用Western Antibody Dilution Buffer按照合适比例进行稀释。封闭结束后，将稀释好的一抗工作液倒入孵育槽中，室温2h或4Ⰳ过夜。一抗孵育结束后，加入TBST Buffer洗涤。

手机拍月亮𐟓𘯼Œ5步成大片！ 1️⃣ 快门速度（S）：建议设置为1/200秒到1/1000秒。月亮亮度较高，快速快门能防止过曝，同时减少手抖模糊。 2️⃣ 感光度（ISO）：推荐50-100。低ISO有助于减少噪点，让月亮细节更清晰，避免过亮导致纹理丢失。 3️⃣ 对焦模式（AF）：选择手动对焦（MF），并将对焦距离调至最远。手动对焦能确保月亮轮廓清晰，自动对焦可能无法准确对焦。 4️⃣ 曝光补偿（EV）：调整至-4.0左右。降低曝光补偿能增强月亮与背景的明暗对比，突出月亮效果。 5️⃣ 白平衡（WB）：若追求真实色彩，可设4500K-5000K；若想创造特殊氛围，可根据需要调整白平衡值。

WB实验封闭液：速封VS脱脂在进行Western Blot（WB）实验时，封闭液的选择至关重要，它能够影响实验的最终结果。封闭液的主要作用包括：阻止非特异性结合最小化非特异性背景保持膜湿润如果封闭效果不佳，会增加背景信号，降低目标蛋白的信号强度，从而影响实验效果。以下是两种常见的封闭液：脱脂奶粉和BSA，以及它们各自的优缺点。脱脂奶粉 𐟥› 优点：价格便宜，容易购买。缺点：成分复杂，适用范围有限。温度过高时容易变质，产生异味或絮状沉淀。封闭时间长，通常需要在室温下放置2小时，或者4℃过夜。含有少量生物素和碱性磷酸酶残留，可能导致背景增加。自身含有生物素，不能用于生物素标记的抗体系统。 BSA 𐟧스𜘧‚𙯼š成分单一，适用于大多数情况。缺点：封闭时间长，通常需要在室温下放置2小时，或者4℃过夜。用量大，成本较高。 BSA有很强的免疫原性，可能导致产生针对BSA的抗体，从而产生交叉反应。动物源，可能含有杂质，与一抗、二抗非特异性结合。新型快速封闭液 𐟚€ 随着科技的进步，现在有一种新型的封闭液可以替代脱脂奶粉和BSA，它具有以下优点：封闭时间短，仅需10分钟。兼容室温、低温、37℃等多种温度。成分单一明确，无动物源，不与抗体非特异性结合。能够有效降低背景，提高信噪比。封闭效果优于传统封闭液及其他同类封闭液。选择合适的封闭液能够确保WB实验的顺利进行，并获得高质量的实验结果。

𐟔젨磦žWB实验中的非特异性条带现象 𐟌ˆ 𐟓Š 案例一：无信号的尴尬可能原因：抗体加错、转膜问题等。解决方案：仔细检查抗体，确认转膜无误。经验：若X光片完全无显色，抗体加错可能性大。若有细微条带，可能是蛋白上样量不足或一抗浓度过低。 𐟓Š 案例二：高背景的困扰可能原因：封闭不充分、一抗浓度过高、洗膜时间不足。解决方案：降低一抗浓度，增加洗膜时间。经验：高背景常见于WB中，目的条带清晰但背景弥漫。注意操作规范，洗膜时间不少于5min*5次或10min*3次。 𐟓Š 案例三：非特异性条带的挑战可能原因：一抗非特异性结合。解决方案：更换一抗。经验：非特异性条带多因一抗质量不佳。可利用阴性对照和阳性对照确定目的条带。 𐟓Š 案例四：边缘规则的白圈可能原因：电转中膜与胶之间存在气泡。解决方案：转膜前去除气泡。经验：电转液倒入盘内，高度与滤纸齐平。检查滤纸与胶之间有无气泡，用U型膜接触胶中间，慢慢放下膜。 𐟓Š 案例五：条带中间出现白色（反白）可能原因：中心部位底物消耗过快。解决方案：降低蛋白量，降低一抗和二抗浓度。经验：在底物消耗前定影X光片，或从降低蛋白量和抗体浓度入手。

𐟌€解决WB条状高背景的探索之旅𐟔 家人们，有没有遇到过这种情况？转膜后丽春红染色看起来没问题，但增加洗膜时间后背景依旧。封闭或抗体不均匀？（虽然看起来都浸没了）如果膜再生，重新封闭孵抗体还有希望吗？𐟘⊊6月17日更新：有趣的是，因为怀疑是非特异结合，所以没有膜再生，直接用TBST洗了一下午，周末又孵育了新配的一抗。第一次显色效果如P2所示，条带还是挺漂亮的。担心显色液不均匀，又曝光了一次，结果出现了类似的高背景。目前考虑：1、一抗效价降低导致与蛋白结合不足；2、膜本身存在问题，可能是干燥或封闭不足（转膜时师妹帮忙操作了一部分，具体不详）。今天进行了膜再生，准备孵另一个抗体试试，期待后续结果。𐟔

WB实验迷茫？看这篇就够！ 1⃣️ 如何避免胶跑得不漂亮？配胶：清洗玻璃板并检查是否漏气，避免胶凝固不均匀。倒胶时要充分混合并去除气泡。双蒸水或乙醇隔离时，缓慢加入，避免稀释分离胶。平衡：将配置好的胶放入点泳池，室温放置10分钟，待胶与电泳液温度一致再进行电泳。上样：拔出上样梳时要保持水平，避免上样孔倾斜。在样品两侧增加等体积的空白1x loading buffer孔，避免两侧样品条带扩宽。电泳：小电压能使胶的分子筛效应更好。电压越小，条带越漂亮。浓缩胶55V，分离胶75V电泳效果最佳，但时间长。 2⃣️ 电泳中常见现象： “︶” 条带呈笑脸状 “︵” 条带呈皱眉状条带拖尾纹理（纵向条纹）条带偏斜条带两边扩散 3⃣️ 如何降低WB背景？膜封闭不够：建议延长封闭时间，选择合适的封闭液。一抗稀释度不适宜：太高时选择最适宜的抗体稀释度。一抗孵育温度偏高：建议4℃过夜孵育。膜选择不当：NC膜的背景通常比PVDF膜低，但吸附力稍差。膜干燥或反复接触：实验过程中要保持膜的湿润，使用镊子夹取膜。曝光时间过长：可减少曝光时间。 4⃣️ 如何减少杂带？目的蛋白存在多个修饰位点。目的蛋白有其他剪切本。样本处理过程中目的蛋白发生降解（最常见）。上样量过高：适当减少上样量。 5⃣️ 如何解决无信号或信号弱的问题？目标蛋白未提取出来：选用合适的裂解液。目标蛋白表达低：增加上样量。转移不完全或过转移：适当调整转膜的时间和电流。抗体不能识别测试种属的相关蛋白。一抗孵育时间不足：建议4℃结合过夜。二抗与一抗不匹配：选择针对一抗来源的种属的抗体。洗膜过度：缩短洗膜时间。 6⃣️ 其它现象：膜上多处出现黑点或黑斑：抗体与封闭试剂发生非特异性结合，或奶粉未充分溶解粘在膜上。反白（条带显白色）：目的蛋白含量太高或一抗浓度偏高。蛋白分子量偏低或偏高：胶浓度不适合，高分子量要用低浓度胶；小分子蛋白要用高浓度胶。

吐温20在WB实验中的神奇作用大家好，今天我们来聊聊吐温20在WB（蛋白质免疫印迹）实验中的神奇作用。吐温20是一种非离子型表面活性剂，在WB实验中可是个不可或缺的角色哦！首先，吐温20在洗液中的作用是封闭膜上蛋白的非结合位点。这就像是给蛋白穿上了一层“保护衣”，能够有效降低背景，让我们的抗体检测更加准确、特异性更强。如果你在做WB实验时发现背景总是很高，那很有可能是吐温20没有发挥好它的封闭作用。另外，吐温20还能保护抗原抗体蛋白。在整个实验过程中，它能减少抗体对抗原的非特异性作用，帮助我们洗脱未结合的抗体，让真正特异性结合的抗体留下来。这对于我们最终得到准确的实验结果至关重要。总之，吐温20在WB实验中扮演着非常重要的角色，它的存在能够大大提高实验的准确性和可靠性。大家在做WB实验的时候，可一定要注意吐温20的正确使用哦！𐟒–

WB实验常见问题及原因总结 𐟔 转膜不充分膜未完全湿透：使用100%甲醇浸透膜。靶蛋白分子量小：选择小孔径膜，缩短转移时间。靶蛋白等电点接近缓冲液pH：尝试使用CAPS缓冲液（pH 10.5）或低pH缓冲液如乙酸缓冲液。甲醇浓度过高：降低甲醇浓度，或使用乙醇或异丙醇代替。转移时间不足：对于厚胶和高分子量蛋白，延长转移时间。 𐟌ˆ 背景高膜未完全湿透：使用100%甲醇浸透膜。洗膜不充分：增加洗液体积和洗涤次数。阻断不充分：增加封闭液孵育时间，提高温度，选择合适的封闭试剂（脱脂奶粉、BSA、酪蛋白等）。二抗浓度过高：降低二抗浓度。膜干燥：保证充分的反应液，避免干膜现象。曝光过度：缩短曝光时间。抗体与阻断蛋白交叉反应：检测抗体与阻断蛋白的交叉反应性，选择无交叉反应的封闭剂。洗涤液中加入Tween-20可减少交叉反应。 𐟚렦𒡦œ‰阳性条带抗体染色不充分：增加抗体浓度，延长孵育时间。酶失活：直接将酶和底物混合，如果不显色则说明酶失活。选择在有效期内、有活性的酶联物。标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低：设置阳性对照，如果阳性对照有结果，但标本没有，则可能是标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。可考虑增加标本上样量。试剂不匹配：一抗与组织种属、一抗与二抗或底物与酶系统之间不匹配。通过设置内参照验证二级检测系统的有效性。一抗失效：选择在有效期内抗体；现配现用工作液。 HRP抑制剂：所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠。

Pulldown-Mass和Pulldown-WB检测要点：（1）试验设计：尽量进行试验组别设计和生物学重复检测，提高后续验证的阳性率。常规过表达单组（对照组 vs 实验组），根据目的设计适当的生物学重复。如果后续以Pulldown-Mass数据进行互作组标准分析，则需要3-4组生物学重复；如果后续以寻找关键互作蛋白，进行深入的机制研究，则建议1-2次生物学重复。经验显示单次重复假阳性率达90%。（2）细胞量：细胞用量要求不少于5E7（金标准：320g离心细胞量50，保障项目用量）。（3）银染质控：Pulldown产物考染/银染质控。（4）Pulldown送样建议：Pulldown后需用PBS清洗后，产物直接送样。不建议对蛋白进行洗脱处理送样，避免丢失互作蛋白信息。（5）互作蛋白筛选和验证：数据分析以非标定量信号强度（LFQ intensity和FC>10）作为强阳筛选，以文献查阅，功能匹配，批量Pulldown-WB验证，提高验证成功率。理想Pulldown-MS结果的蛋白定量都到超过1000种蛋白。其中绝大部分蛋白为非特异结合或背景蛋白。以目的蛋白的富集信号强度和差异倍数作为参考（相对强信号和差异），分析实验组中明显定量较高且差异较大的蛋白，作为重要候选蛋白。同时对重要候选蛋白进行STRING互作分析、文献分析和目的蛋白功能匹配分析，选择更优的4-5个蛋白进行Pulldown-WB验证，提高Pulldown-WB成功率。如有相关科研问题，欢迎留言探讨。 #科研#⠂ #研究生日常#⠂ #pulldown#⠂ #实验外包#⠂ #实验室日常#

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