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电泳胶背景脏权威发布_电泳胶背景脏的原因(2024年12月精准访谈)

内容来源：蜂巢动画所属栏目：观点更新日期：2024-12-01

电泳胶背景脏

WB实验注意事项：战胜西方印记的秘诀！ 𐟓Š 电泳注意事项制胶要均匀：胶越均匀，条带越窄，分离效果越好。压平下层胶：加入下层胶后，用无水乙醇或水压平，避免形成波浪状。上层胶要多配：防止漏液。梳子要垂直：拔出时要小心，可用针头拨正。电泳液回收：次数不宜太多，以免影响电流。电泳液浑浊：及时弃掉，否则影响电泳。上样速度：要快，尽快电泳，冰浴条件下进行。 𐟔„ 电转注意事项戴手套：全程使用手套和镊子，避免直接触碰膜。激活PVDF膜：提前泡在甲醇中激活，再放入转膜液中中和。标记PVDF膜：提前做好标记，方便区分。选择合适膜：大蛋白用0.45um，小蛋白用0.22um。裁膜：注意胶的大小，过大过小都会影响转膜。滤纸：薄滤纸两侧各用两张，厚滤纸两侧各垫一张。气泡：转膜时不能出现气泡，要及时排出。冰浴：转膜时释放大量热量，冰浴至关重要。 𐟔’ 封闭注意事项封闭液比例：注意配置比例，切勿配错。摇匀封闭液：摇匀封闭液，避免背景脏。封闭液使用次数：封闭液出现颗粒感时就不能用了。 𐟐𐠥�𘀦Š—二抗注意事项稀释比例：注意一二抗的稀释比例，仔细阅读说明书。选择一抗：根据样本选择一抗，根据一抗种属选择二抗。有效期：在有效期内使用一二抗。孵育条件：一抗建议4℃冰箱中摇床孵育过夜，防止背景高。通过这些注意事项，你可以更好地掌握WB实验的技巧，提高实验结果的准确性。

𐟔젗B实验常见问题解答集锦一. 𐟏… 电泳常见问题电泳条带扭曲：可能是电泳槽内部电泳液未加满或漏液，及时加满电泳液可使条带变直。电泳条带拖尾：样本溶解不均匀可能导致拖尾，确保样本溶解后再上样。电泳条带扩散：加样量过多会导致条带扩散，适当减少上样量可改善。溴酚蓝呈笑脸状：泳道底部中间高、两边低，可能是制胶试剂温度高或制胶后未及时保湿，导致胶不均匀冷切。可降低电压，缓慢电泳，或在冰浴条件下进行。二. 𐟔„ 电转常见问题膜转反：注意“黑胶红膜”原则，即转膜夹黑色部分对应胶，红色部分对应膜。转膜夹放置错误：确保转膜夹红色对红色，黑色对黑色。背景有气泡：转膜过程中气泡会导致不均匀的白色斑点，转膜时要仔细检查，避免气泡产生。三. 𐟔’ 封闭常见问题背景脏：封闭不充分可能导致背景脏，可延长封闭时间或更换封闭液。条带有黑色斑点：封闭液未完全溶解会导致黑色斑点，封闭液需充分摇匀。条带信号弱：过度封闭可能使信号弱，可适当降低封闭液浓度或更换封闭液。封闭时间过长：封闭时间过长可能影响抗原抗体结合，建议封闭时间为常温1-2小时，并减少封闭液中的蛋白浓度。膜上有黑点和黑斑：可能是膜上其他部位与一抗或二抗非特异性结合，封闭液需完全溶解并混匀，选择纯牛奶作为封闭液，封闭后彻底清洗。非均一性背景：膜可能过干导致非均一性背景，操作过程中注意保持膜湿润。非特异性条带：封闭不彻底可能导致非特异性条带，重新调整封闭条件，选择适合的封闭液，适当提高封闭物浓度，延长封闭时间。抗体与封闭试剂反应：使用前过滤封闭试剂可避免此问题。四. 𐟐 孵一抗二抗常见问题蛋白条带信号弱：抗体孵育不完全可能导致信号弱，增加抗体浓度和延长孵育时间可改善。背景有白色斑点：抗体孵育不均匀可能导致不均匀的白色斑点，孵育抗体时使用摇床可避免此问题。

Abmart抗体真香！实验成功秘诀大公开 Abmart的抗体真的太好用啦！比国内很多抗体都有优势，效果明显，几乎没有杂带，真是国货之光。特别推荐他们的TLR4抗体，简直是我的实验神器。在使用抗体之前，我仔细阅读了说明书，了解了抗体的储存条件和稀释比例。显影后发现条带清晰，背景干净。我的实验步骤如下：提取细胞总蛋白：在冰上进行，确保蛋白的活性。加入loading buffer：收集完蛋白后，加入loading buffer，100度煮10分钟，让蛋白充分变性。 SDS-PAGE电泳：浓缩胶80V，分离胶120V，溴酚蓝跑到底，确保蛋白分离完全。转膜：这个过程特别重要，要注意排出气泡，PVDF膜在甲醇中激活，并且全程在冰浴中进行转膜。电转液要提前放在冰箱中预冷。电转条件为100V恒压，60分钟。封闭：提前一个小时配牛奶，室温封闭一个小时，确保背景干净。感谢Abmart提供这么好的抗体，让我的实验如此顺利！𐟒갟’

WB实验背景脏？6个步骤教你解决！在进行WB（Western Blot）实验时，背景脏是一个常见的问题。𐟘“ 明明跑出了想要的趋势，但背景却一团糟，这该如何解决呢？其实，背景脏并不一定是因为仪器不干净，也可能是蛋白降解或者实验条件不合适导致的。以下是一些可能出错的关键步骤，以及如何避免这些问题的建议：实验准备首先，确保所有用于提取蛋白的研磨器材、制胶的玻璃板和梳子都清洗干净。如果这些器材长时间不使用，建议在使用前再次清洗，以杜绝污染。提取蛋白选择合适的蛋白裂解液，这样可以去除一些干扰因素，如核酸、多糖和脂类等。蛋白在测量浓度后应变性分装保存，避免反复冻融导致蛋白降解。此外，确保Loading buffer在保质期内，并在加入蛋白后充分混匀，再煮沸变性。制胶在制胶过程中，玻璃板夹紧后，有些人习惯性加水测试是否漏胶。建议用蒸馏水而不是自来水测试，测试结束后要将玻璃板之间的水倒干净，用滤纸吸干残留的水。灌胶前要将配好的试剂充分混匀，灌胶时要掌握好速度，缓慢加入，避免产生气泡。灌注好分离胶后，缓缓加入无水乙醇封胶，速度一定要慢，防止胶面被冲变形。温度较高时，30分钟左右就会凝固；冬天气温较低可能需要较长时间。若分离胶液面不平，会影响后期蛋白电泳的效果。转膜转膜前需在转膜板两侧各放置3至4张滤纸（两侧数量相同）。切记不要用手直接接触PVDF膜和滤纸，手上的油脂会对其造成污染，务必佩戴干净的手套，全程尽量使用镊子夹取。转膜过程中海绵-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-海绵每一层的气泡要排空。转膜时要使整个电转仪置于冰水混合物中，常用220V或者其他高电压进行。机器温度升高会使蛋白降解，导致转膜后条带跑糊，发光后条带和背景也会脏得一塌糊涂。孵育抗体孵育一抗的时间大多选择4℃过夜，也可以室温封闭2小时。4℃过夜效果会比室温好。二抗孵育的时间不宜过长，一般是室温下摇床孵育1到2小时。抗体孵育完成后要清洗干净，特别是二抗孵育完成后，否则可能导致显影结果出现高背景。发光液配置大部分实验室使用的ECL发光液，A液和B液按照1:1的比例配置。发光液要求现用现配，每次根据使用量合理配置用液量。发光液配置时间过长同样会引起发光效果不好，背景脏或者漆黑一片。通过以上步骤，可以有效解决WB实验背景脏的问题，让你的实验结果更加清晰准确！𐟒ꀀ

考马斯亮蓝染色法全攻略，实验达人必看！ 𐟌Ÿ实验原理：考马斯亮蓝染色法是一种利用考马斯亮蓝G250染料检测蛋白质的方法。这种染料能与蛋白质结合，适用于SDS-PAGE或非变性PAGE等蛋白凝胶的染色，也可用于Western Blot转膜后PAGE胶上残留蛋白的检测。 𐟓Œ操作步骤：清洗杂质：取出电泳后的蛋白胶，放入干净的器皿中，用纯水清洗三次，每次20秒。这一步是为了去除凝胶中的干扰杂质。如果胶比较厚，可以适当增加洗涤次数和延长洗涤时间。染色：倒出纯水后，加入适量的考马斯亮蓝超快染色液，使染液覆盖整个凝胶。将器皿放入水平摇床上震荡染色，直至看到清晰的蛋白染色条带（大约30分钟到2小时，时间主要取决于凝胶厚度）。观察色带：染色过程中要注意观察凝胶的变色情况，避免染色时间过长导致背景颜色过深。脱色：倒出染色液，用纯水振荡清洗30分钟。脱色时间越长，背景颜色越浅。根据实验需求调整脱色时间，如需要更低背景的凝胶，可用纯水脱色1小时以上或过夜。 𐟓Œ注意事项：考马斯亮蓝染色液呈酸性，有轻微腐蚀性，操作过程中一定要佩戴手套，避免染料接触皮肤。考马斯亮蓝染料有毒性，不建议加热使用。操作后需妥善处理废弃物。染色前用纯水清洗能大大减少SDS等干扰杂质。染色后请尽快拍照，纯水长时间浸泡会导致蛋白和染料的流失。考马斯亮蓝染色一般是不可逆的，丽春红染色是可逆的，但丽春红用于转膜之后，对印迹膜的染色检测，各位同门可别用错了~ 𐟓Œ常见问题：凝胶背景颜色深：电泳时凝胶被污染，或者是染色操作时被污染。前者可以尝试更换新的电泳液，电泳槽内用纯水冲洗干净；后者可以使用专门的容器，使用前用纯水冲洗干净，或者操作时更换新的手套。蛋白条带太浓：样品上样浓度过高，可以对样品进行稀释。样品串样品孔，无法分析结果：电泳点样时飘出胶孔，可以更换点样专用吸头，将样品加到胶孔底部，制样时加入足量的loading buffer。以上就是本次经验分享，欢迎各位互联网师兄师姐在评论区交流，有无极品条带图让大家眼馋一下𐟘‰

WB转膜必知的10个关键点，不看后悔！ WB转膜的十大注意事项⬇️ 1⃣️ 膜转反了𐟑‰ 转膜时记住“黑胶白膜”，即黑色部分对应膜，白色部分对应胶。 2⃣️ 膜上有气泡𐟑‰ 滤纸要充分浸湿，盖上滤纸后用左手轻压，右手用切胶板轻刮排掉气泡，冰浴转膜。 3⃣️ PVDF膜准备不足𐟑‰ PVDF膜具有疏水性，先在甲醇中浸泡激活3分钟，再用超纯水洗10秒，最后放到新配的转膜液中平衡1分钟再进行转膜。 4⃣️ 转膜后分不清蛋白面𐟑‰ 转膜前用剪刀在膜的右上角切掉一部分做标记，或者用圆珠笔在蛋白面（紧贴着胶的那一面）做标记区分，一侧1孔加marker一侧两孔加marker（有预算可以选择）。 5⃣️ 滤纸选择困难𐟑‰ 薄滤纸（1cm以下）可以一侧垫两张，厚滤纸一侧垫一张即可，根据转膜次数增多滤纸会变薄，需考虑更换会增加滤纸数量。 6⃣️ 转膜液保存不当𐟑‰ 10*转膜液需保存在4度冰箱，1*转膜液不可以长期保存，最好不要回收使用，否则影响转膜效率。 7⃣️ 显影后膜很脏𐟑‰ 避免手直接接触膜，使用镊子夹膜的marker部分，全程手套，手上的油脂等会影响转膜效率产生背景污斑。 8⃣️ 裁剪的膜和滤纸不合适𐟑‰ 如果膜裁切过大，会导致电流不能均匀通过膜，影响转膜并且浪费；如果膜裁切过小则影响实验。 9⃣️ 切胶不当𐟑‰ 切胶时注意切胶板垂直向下切胶，保证胶面整齐防止裂开。 𐟔Ÿ 冰浴很重要𐟑‰ 有条件尽量用冰块事先填满转膜电泳槽四周，以预先降低温度，没有条件可以用冰袋和水代替（不是非常推荐）。 ❤️ 下期预告：WB相关溶液的配制（转膜液、电泳液等）

初学WB的那些事儿：国庆节在实验室度过𐟘능…𓤺Ž转膜和封闭的一些小心得，分享给大家。转膜过程的小窍门 𐟧ꊦˆ‘的蛋白大小从80kDa到12kDa不等，用的是恒压100V转膜1.5小时。师姐推荐用不含SDS的转膜液，效果更好，不过具体原因我也不太清楚。转膜过程中，机器有时会报错停止工作，所以在冰上覆盖降温是个好办法。师姐说在冰里掺些水效果更好，能维持低温。转膜液在电泳步骤时就要预冷。现配转膜液 𐟕𐯸 转膜液最好是现配，时间久了甲醇会挥发。重复利用的转膜液可以把用于激活PVDF膜的甲醇倒进去补充甲醇。小分子用0.22微米的膜，PVDF膜要激活泡甲醇泡一会儿就行，NC膜不需要激活。有一次我误把NC膜泡甲醇里了，结果泡烂了，真是哭笑不得。取胶要轻柔 𐟙ˆ 取胶的时候一定要轻柔，不然胶会碎掉。切去多余的胶，有时候胶的边缘会卷曲，一定要切掉，否则会有气泡产生。膜和胶相贴的那一面一定不能用手碰，要用镊子夹住去放。胶不怕碰脏，膜怕脏！一般膜和胶贴合的那一面没气泡，后续结果就很少有气泡产生。胶不能放反了 𐟧튨ƒ𖤸能放反了，我是固定左侧上样，放入三明治夹的时候，上样侧在我的右手边置于三明治的黑色夹子上，这样不会转反。切膜的小技巧 ✂️ 转膜后切膜的时候一定要膜和胶贴在一起用剪子剪，否则膜很容易就干了。切完再取下膜封闭。如果膜干了在封闭的过程中会慢慢恢复过来，不用担心，最好等恢复过来再敷抗体。封闭过程 𐟥› 一般用5%脱脂牛奶封闭1小时就可以了。脱脂牛奶可以在转膜开始后配置，放摇匀机充分摇匀混匀，以免牛奶未充分溶解影响结果。快速封闭液 ⏱️ 我用的是快速封闭液，15分钟封闭。本来想重复利用，结果隔几天再用结果背景全黑，所以还是一次性用吧。希望这些小心得能帮到大家，科研路上大家一起加油！𐟒ꀀ

WB实验迷茫？看这篇就够！ 1⃣️ 如何避免胶跑得不漂亮？配胶：清洗玻璃板并检查是否漏气，避免胶凝固不均匀。倒胶时要充分混合并去除气泡。双蒸水或乙醇隔离时，缓慢加入，避免稀释分离胶。平衡：将配置好的胶放入点泳池，室温放置10分钟，待胶与电泳液温度一致再进行电泳。上样：拔出上样梳时要保持水平，避免上样孔倾斜。在样品两侧增加等体积的空白1x loading buffer孔，避免两侧样品条带扩宽。电泳：小电压能使胶的分子筛效应更好。电压越小，条带越漂亮。浓缩胶55V，分离胶75V电泳效果最佳，但时间长。 2⃣️ 电泳中常见现象： “︶” 条带呈笑脸状 “︵” 条带呈皱眉状条带拖尾纹理（纵向条纹）条带偏斜条带两边扩散 3⃣️ 如何降低WB背景？膜封闭不够：建议延长封闭时间，选择合适的封闭液。一抗稀释度不适宜：太高时选择最适宜的抗体稀释度。一抗孵育温度偏高：建议4℃过夜孵育。膜选择不当：NC膜的背景通常比PVDF膜低，但吸附力稍差。膜干燥或反复接触：实验过程中要保持膜的湿润，使用镊子夹取膜。曝光时间过长：可减少曝光时间。 4⃣️ 如何减少杂带？目的蛋白存在多个修饰位点。目的蛋白有其他剪切本。样本处理过程中目的蛋白发生降解（最常见）。上样量过高：适当减少上样量。 5⃣️ 如何解决无信号或信号弱的问题？目标蛋白未提取出来：选用合适的裂解液。目标蛋白表达低：增加上样量。转移不完全或过转移：适当调整转膜的时间和电流。抗体不能识别测试种属的相关蛋白。一抗孵育时间不足：建议4℃结合过夜。二抗与一抗不匹配：选择针对一抗来源的种属的抗体。洗膜过度：缩短洗膜时间。 6⃣️ 其它现象：膜上多处出现黑点或黑斑：抗体与封闭试剂发生非特异性结合，或奶粉未充分溶解粘在膜上。反白（条带显白色）：目的蛋白含量太高或一抗浓度偏高。蛋白分子量偏低或偏高：胶浓度不适合，高分子量要用低浓度胶；小分子蛋白要用高浓度胶。

WB实验全攻略：12个关键步骤详解 1. 𐟧𜠥ꌥ‡†备：确保所有用于提取蛋白的耗材和实验所需物品都已清洗干净。电泳玻璃板应放在置物架上隔开，以避免长期放置后黏连。 𐟒砦Š𝦏蛋白：在整个过程中，抽提蛋白的操作应在冰上进行。裂解液加入后，细胞会被破坏，细胞内的酶会被释放。不在冰上操作会导致蛋白降解。一旦开始抽提，应一次性操作至加入loading Buffer煮蛋白变性。变性后的蛋白不易降解，可以长期保存于-80℃。 𐟧꠩…胶：确保所有配胶所需的试剂都在有效期内。配制分离胶和浓缩胶时，需快速颠倒混合均匀。分离胶需要用去离子水压一下，以去除气泡和压平液面。分离胶凝固后再配浓缩胶，插入孔梳时要快，浓缩胶的凝固时间比分离胶短。为了避免浓缩胶插梳子时有气泡，可以先将浓缩胶倒满，斜着插入，记得梳子的正反一定要放对，否则玻璃板会碎。 𐟔堧…𗯼š蛋白加上loading Buffer后一定要充分混匀，再去煮使蛋白变性。 𐟓 上样：为了美观，需要定量上样。根据BSA与BCA试剂AB现配现用，静置5分钟后检测，计算出每个样本的浓度，定量上样量计算每孔上样量。 ⚡ 电泳：浓缩胶80v30分钟，分离胶120v55分钟（分离胶的时间根据样本跑到图中这条线停止）。 𐟓‘ 转膜：不要直接用手接触膜与滤纸，手上油脂会对其造成污染。佩戴干净手套全程尽量用镊子夹取，避免每一层之间的气泡，让胶与膜之间美美贴合。三层我用的是滤纸，如果有气泡产生一定要拿平的板赶一下气泡。 ❄️ 温度：转膜液现配现用，等需转膜用时再从4℃冰箱中拿出用。一般会在盒子里放上2冰袋，盖上盒子之后再用冰袋和冰块覆盖严实。 𐟕’ 浸泡：封闭液需要充分溶解，不充分溶解会导致曝光时背景脏或一片漆黑。浸泡时间要足够，我一般用震荡机溶解配好的封闭液，浸泡1小时（根据抗体情况可适当延长封闭时间）。膜先在甲醇中浸泡30秒，再在转膜液中浸泡一分钟。 𐟦 抗体孵育：一抗和二抗购买哪家的抗体可在官网找到稀释比例，一般范围值内的我选用最大的稀释倍数。一抗4℃孵育过夜，二抗孵育时间90分钟。 𐟚🠦𔗨†œ：洗膜一定要洗干净，一抗洗3次，每次10分钟；二抗洗4次，每次10分钟。 𐟓𘠦›光：发光液现配现用，时间过长会引起发光效果不好，背景脏或一片漆黑。发光液及拍摄都需避光。

深入了解：Northern杂交揭秘 Northern杂交（Northern blot），这项由斯坦福大学的James Alwine、David Kemp和George Stark于1977年共同发明的技术，是用于研究基因表达水平的强大工具。𐟔슊𐟌𑠥ꌦ�ꤦ您爯𜚊RNA提取：从细胞或组织中提取总RNA，或通过寡聚（dT）纯化柱分离纯化得到mRNA。电泳分离：RNA样本通过电泳依据分子量大小进行分离。常用的电泳胶是含有甲醛的琼脂糖凝胶，甲醛有助于减少RNA的二级结构。对于小分子的RNA或microRNA，聚丙烯酰胺变性胶电泳是更佳选择。转膜：凝胶上的RNA分子被转移到膜上。膜通常带有正电荷，与带负电荷的核酸分子结合得很好。转膜缓冲液中含有甲酰胺，能降低RNA样本与探针的退火温度，减少高温对RNA的降解。固定：RNA分子转移到膜上后，需经过烘烤或紫外交联等方法加以固定。杂交：使用与检测目的基因序列互补配对的被标记探针与RNA探针杂交。探针可以是DNA、RNA或其他寡聚核苷酸，长度需大于25bp。体外合成的RNA探针可采用更高的退火温度以减少背景噪音。常用的标记物有P或地高辛等。信号检测：杂交过后，可采用X胶片显色等方法来检测信号。 𐟌🠎orthern杂交的应用：用于检测不同组织、器官以及生物体不同发育阶段或胁迫、病理环境下特定基因的表达情况。检测目的基因是否具有可变剪切产物或者重复序列。 𐟌Ÿ 技术特点：与其他基因表达分析方法相比，Northern blot的灵敏度不如定量PCR，但特异性较高，可有效减少实验结果的假阳性。其灵敏度通常优于基因芯片实验，不过基因芯片可在一次实验中同时反映出几千个基因表达量的变化。 ⚠️ 注意事项：在进行Northern blot实验时，需注意RNA容易降解，因此所有实验用品都需要经过除去RNA酶的处理，如高温烘烤、DEPC处理等。同时，实验中用到的甲醛、EB、DEPC、紫外灯等对人体有一定伤害，操作时应注意防护。

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