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电泳胶背景脏权威发布_电泳胶背景脏的原因(2024年12月精准访谈)

内容来源：蜂巢动画所属栏目：观点更新日期：2024-12-04

电泳胶背景脏

WB实验注意事项：战胜西方印记的秘诀！ 𐟓Š 电泳注意事项制胶要均匀：胶越均匀，条带越窄，分离效果越好。压平下层胶：加入下层胶后，用无水乙醇或水压平，避免形成波浪状。上层胶要多配：防止漏液。梳子要垂直：拔出时要小心，可用针头拨正。电泳液回收：次数不宜太多，以免影响电流。电泳液浑浊：及时弃掉，否则影响电泳。上样速度：要快，尽快电泳，冰浴条件下进行。 𐟔„ 电转注意事项戴手套：全程使用手套和镊子，避免直接触碰膜。激活PVDF膜：提前泡在甲醇中激活，再放入转膜液中中和。标记PVDF膜：提前做好标记，方便区分。选择合适膜：大蛋白用0.45um，小蛋白用0.22um。裁膜：注意胶的大小，过大过小都会影响转膜。滤纸：薄滤纸两侧各用两张，厚滤纸两侧各垫一张。气泡：转膜时不能出现气泡，要及时排出。冰浴：转膜时释放大量热量，冰浴至关重要。 𐟔’ 封闭注意事项封闭液比例：注意配置比例，切勿配错。摇匀封闭液：摇匀封闭液，避免背景脏。封闭液使用次数：封闭液出现颗粒感时就不能用了。 𐟐𐠥�𘀦Š—二抗注意事项稀释比例：注意一二抗的稀释比例，仔细阅读说明书。选择一抗：根据样本选择一抗，根据一抗种属选择二抗。有效期：在有效期内使用一二抗。孵育条件：一抗建议4℃冰箱中摇床孵育过夜，防止背景高。通过这些注意事项，你可以更好地掌握WB实验的技巧，提高实验结果的准确性。

𐟔젗B实验常见问题解答集锦一. 𐟏… 电泳常见问题电泳条带扭曲：可能是电泳槽内部电泳液未加满或漏液，及时加满电泳液可使条带变直。电泳条带拖尾：样本溶解不均匀可能导致拖尾，确保样本溶解后再上样。电泳条带扩散：加样量过多会导致条带扩散，适当减少上样量可改善。溴酚蓝呈笑脸状：泳道底部中间高、两边低，可能是制胶试剂温度高或制胶后未及时保湿，导致胶不均匀冷切。可降低电压，缓慢电泳，或在冰浴条件下进行。二. 𐟔„ 电转常见问题膜转反：注意“黑胶红膜”原则，即转膜夹黑色部分对应胶，红色部分对应膜。转膜夹放置错误：确保转膜夹红色对红色，黑色对黑色。背景有气泡：转膜过程中气泡会导致不均匀的白色斑点，转膜时要仔细检查，避免气泡产生。三. 𐟔’ 封闭常见问题背景脏：封闭不充分可能导致背景脏，可延长封闭时间或更换封闭液。条带有黑色斑点：封闭液未完全溶解会导致黑色斑点，封闭液需充分摇匀。条带信号弱：过度封闭可能使信号弱，可适当降低封闭液浓度或更换封闭液。封闭时间过长：封闭时间过长可能影响抗原抗体结合，建议封闭时间为常温1-2小时，并减少封闭液中的蛋白浓度。膜上有黑点和黑斑：可能是膜上其他部位与一抗或二抗非特异性结合，封闭液需完全溶解并混匀，选择纯牛奶作为封闭液，封闭后彻底清洗。非均一性背景：膜可能过干导致非均一性背景，操作过程中注意保持膜湿润。非特异性条带：封闭不彻底可能导致非特异性条带，重新调整封闭条件，选择适合的封闭液，适当提高封闭物浓度，延长封闭时间。抗体与封闭试剂反应：使用前过滤封闭试剂可避免此问题。四. 𐟐 孵一抗二抗常见问题蛋白条带信号弱：抗体孵育不完全可能导致信号弱，增加抗体浓度和延长孵育时间可改善。背景有白色斑点：抗体孵育不均匀可能导致不均匀的白色斑点，孵育抗体时使用摇床可避免此问题。

Abmart抗体真香！实验成功秘诀大公开 Abmart的抗体真的太好用啦！比国内很多抗体都有优势，效果明显，几乎没有杂带，真是国货之光。特别推荐他们的TLR4抗体，简直是我的实验神器。在使用抗体之前，我仔细阅读了说明书，了解了抗体的储存条件和稀释比例。显影后发现条带清晰，背景干净。我的实验步骤如下：提取细胞总蛋白：在冰上进行，确保蛋白的活性。加入loading buffer：收集完蛋白后，加入loading buffer，100度煮10分钟，让蛋白充分变性。 SDS-PAGE电泳：浓缩胶80V，分离胶120V，溴酚蓝跑到底，确保蛋白分离完全。转膜：这个过程特别重要，要注意排出气泡，PVDF膜在甲醇中激活，并且全程在冰浴中进行转膜。电转液要提前放在冰箱中预冷。电转条件为100V恒压，60分钟。封闭：提前一个小时配牛奶，室温封闭一个小时，确保背景干净。感谢Abmart提供这么好的抗体，让我的实验如此顺利！𐟒갟’

WB实验背景脏？6个步骤教你解决！在进行WB（Western Blot）实验时，背景脏是一个常见的问题。𐟘“ 明明跑出了想要的趋势，但背景却一团糟，这该如何解决呢？其实，背景脏并不一定是因为仪器不干净，也可能是蛋白降解或者实验条件不合适导致的。以下是一些可能出错的关键步骤，以及如何避免这些问题的建议：实验准备首先，确保所有用于提取蛋白的研磨器材、制胶的玻璃板和梳子都清洗干净。如果这些器材长时间不使用，建议在使用前再次清洗，以杜绝污染。提取蛋白选择合适的蛋白裂解液，这样可以去除一些干扰因素，如核酸、多糖和脂类等。蛋白在测量浓度后应变性分装保存，避免反复冻融导致蛋白降解。此外，确保Loading buffer在保质期内，并在加入蛋白后充分混匀，再煮沸变性。制胶在制胶过程中，玻璃板夹紧后，有些人习惯性加水测试是否漏胶。建议用蒸馏水而不是自来水测试，测试结束后要将玻璃板之间的水倒干净，用滤纸吸干残留的水。灌胶前要将配好的试剂充分混匀，灌胶时要掌握好速度，缓慢加入，避免产生气泡。灌注好分离胶后，缓缓加入无水乙醇封胶，速度一定要慢，防止胶面被冲变形。温度较高时，30分钟左右就会凝固；冬天气温较低可能需要较长时间。若分离胶液面不平，会影响后期蛋白电泳的效果。转膜转膜前需在转膜板两侧各放置3至4张滤纸（两侧数量相同）。切记不要用手直接接触PVDF膜和滤纸，手上的油脂会对其造成污染，务必佩戴干净的手套，全程尽量使用镊子夹取。转膜过程中海绵-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-海绵每一层的气泡要排空。转膜时要使整个电转仪置于冰水混合物中，常用220V或者其他高电压进行。机器温度升高会使蛋白降解，导致转膜后条带跑糊，发光后条带和背景也会脏得一塌糊涂。孵育抗体孵育一抗的时间大多选择4℃过夜，也可以室温封闭2小时。4℃过夜效果会比室温好。二抗孵育的时间不宜过长，一般是室温下摇床孵育1到2小时。抗体孵育完成后要清洗干净，特别是二抗孵育完成后，否则可能导致显影结果出现高背景。发光液配置大部分实验室使用的ECL发光液，A液和B液按照1:1的比例配置。发光液要求现用现配，每次根据使用量合理配置用液量。发光液配置时间过长同样会引起发光效果不好，背景脏或者漆黑一片。通过以上步骤，可以有效解决WB实验背景脏的问题，让你的实验结果更加清晰准确！𐟒ꀀ

WB实验详解，一文搞定！ Western blot（WB）是一种常用的蛋白质检测技术，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（跑胶）将不同大小的蛋白质分离，然后转移到固相载体（膜）上，再通过特异性抗体与目标蛋白质反应，最后通过标记的二抗进行酶促反应或反射自显影检测特定的蛋白质条带。以下是WB实验的详细流程和基本原理。 ✅实验流程样品制备：使用SDS和𗯥Ÿ𚤹™醇处理样品，使蛋白质变性和解聚成单链状态。电泳分离：在PAGE中，蛋白质根据其大小和电荷被分离成不同的条带。转膜：在电流作用下，凝胶中的蛋白质被转移到固相载体（PVDF膜或NC膜）上。封闭：使用牛奶或牛血清蛋白等高蛋白封闭剂孵育，减少抗体的非特异性结合，降低背景。一抗：一抗与蛋白质形成抗原抗体复合物。二抗：二抗与一抗结合。显影：通过底物显色或放射自显影检测信号，从而看出目的蛋白质的相对表达量。 ✅基本原理将不同大小的蛋白质通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（跑胶）分离后，转移到固相载体（膜）上。在通过特异性抗体与目标蛋白质反应（一抗），最后通过标记的二抗进行酶促反应或反射自显影检测特定的蛋白质条带（二抗+显影）。 ✅学会看图首先看内参（如tubulin、actin、gapdh等），一般需要控制内参是一致的，即灰度值相近。再看目的蛋白质的表达量，图的最上面一般会标明每个泳道的蛋白质样是如何处理的，通过不同泳道的灰度值能看出与control相比的目的蛋白质的相对表达量。通过这些步骤，你可以更好地理解和掌握Western blot实验的原理和流程，从而更好地进行实验设计和数据分析。

考马斯亮蓝染色法全攻略，实验达人必看！ 𐟌Ÿ实验原理：考马斯亮蓝染色法是一种利用考马斯亮蓝G250染料检测蛋白质的方法。这种染料能与蛋白质结合，适用于SDS-PAGE或非变性PAGE等蛋白凝胶的染色，也可用于Western Blot转膜后PAGE胶上残留蛋白的检测。 𐟓Œ操作步骤：清洗杂质：取出电泳后的蛋白胶，放入干净的器皿中，用纯水清洗三次，每次20秒。这一步是为了去除凝胶中的干扰杂质。如果胶比较厚，可以适当增加洗涤次数和延长洗涤时间。染色：倒出纯水后，加入适量的考马斯亮蓝超快染色液，使染液覆盖整个凝胶。将器皿放入水平摇床上震荡染色，直至看到清晰的蛋白染色条带（大约30分钟到2小时，时间主要取决于凝胶厚度）。观察色带：染色过程中要注意观察凝胶的变色情况，避免染色时间过长导致背景颜色过深。脱色：倒出染色液，用纯水振荡清洗30分钟。脱色时间越长，背景颜色越浅。根据实验需求调整脱色时间，如需要更低背景的凝胶，可用纯水脱色1小时以上或过夜。 𐟓Œ注意事项：考马斯亮蓝染色液呈酸性，有轻微腐蚀性，操作过程中一定要佩戴手套，避免染料接触皮肤。考马斯亮蓝染料有毒性，不建议加热使用。操作后需妥善处理废弃物。染色前用纯水清洗能大大减少SDS等干扰杂质。染色后请尽快拍照，纯水长时间浸泡会导致蛋白和染料的流失。考马斯亮蓝染色一般是不可逆的，丽春红染色是可逆的，但丽春红用于转膜之后，对印迹膜的染色检测，各位同门可别用错了~ 𐟓Œ常见问题：凝胶背景颜色深：电泳时凝胶被污染，或者是染色操作时被污染。前者可以尝试更换新的电泳液，电泳槽内用纯水冲洗干净；后者可以使用专门的容器，使用前用纯水冲洗干净，或者操作时更换新的手套。蛋白条带太浓：样品上样浓度过高，可以对样品进行稀释。样品串样品孔，无法分析结果：电泳点样时飘出胶孔，可以更换点样专用吸头，将样品加到胶孔底部，制样时加入足量的loading buffer。以上就是本次经验分享，欢迎各位互联网师兄师姐在评论区交流，有无极品条带图让大家眼馋一下𐟘‰

WB转膜必知的10个关键点，不看后悔！ WB转膜的十大注意事项⬇️ 1⃣️ 膜转反了𐟑‰ 转膜时记住“黑胶白膜”，即黑色部分对应膜，白色部分对应胶。 2⃣️ 膜上有气泡𐟑‰ 滤纸要充分浸湿，盖上滤纸后用左手轻压，右手用切胶板轻刮排掉气泡，冰浴转膜。 3⃣️ PVDF膜准备不足𐟑‰ PVDF膜具有疏水性，先在甲醇中浸泡激活3分钟，再用超纯水洗10秒，最后放到新配的转膜液中平衡1分钟再进行转膜。 4⃣️ 转膜后分不清蛋白面𐟑‰ 转膜前用剪刀在膜的右上角切掉一部分做标记，或者用圆珠笔在蛋白面（紧贴着胶的那一面）做标记区分，一侧1孔加marker一侧两孔加marker（有预算可以选择）。 5⃣️ 滤纸选择困难𐟑‰ 薄滤纸（1cm以下）可以一侧垫两张，厚滤纸一侧垫一张即可，根据转膜次数增多滤纸会变薄，需考虑更换会增加滤纸数量。 6⃣️ 转膜液保存不当𐟑‰ 10*转膜液需保存在4度冰箱，1*转膜液不可以长期保存，最好不要回收使用，否则影响转膜效率。 7⃣️ 显影后膜很脏𐟑‰ 避免手直接接触膜，使用镊子夹膜的marker部分，全程手套，手上的油脂等会影响转膜效率产生背景污斑。 8⃣️ 裁剪的膜和滤纸不合适𐟑‰ 如果膜裁切过大，会导致电流不能均匀通过膜，影响转膜并且浪费；如果膜裁切过小则影响实验。 9⃣️ 切胶不当𐟑‰ 切胶时注意切胶板垂直向下切胶，保证胶面整齐防止裂开。 𐟔Ÿ 冰浴很重要𐟑‰ 有条件尽量用冰块事先填满转膜电泳槽四周，以预先降低温度，没有条件可以用冰袋和水代替（不是非常推荐）。 ❤️ 下期预告：WB相关溶液的配制（转膜液、电泳液等）

初学WB的那些事儿：国庆节在实验室度过𐟘능…𓤺Ž转膜和封闭的一些小心得，分享给大家。转膜过程的小窍门 𐟧ꊦˆ‘的蛋白大小从80kDa到12kDa不等，用的是恒压100V转膜1.5小时。师姐推荐用不含SDS的转膜液，效果更好，不过具体原因我也不太清楚。转膜过程中，机器有时会报错停止工作，所以在冰上覆盖降温是个好办法。师姐说在冰里掺些水效果更好，能维持低温。转膜液在电泳步骤时就要预冷。现配转膜液 𐟕𐯸 转膜液最好是现配，时间久了甲醇会挥发。重复利用的转膜液可以把用于激活PVDF膜的甲醇倒进去补充甲醇。小分子用0.22微米的膜，PVDF膜要激活泡甲醇泡一会儿就行，NC膜不需要激活。有一次我误把NC膜泡甲醇里了，结果泡烂了，真是哭笑不得。取胶要轻柔 𐟙ˆ 取胶的时候一定要轻柔，不然胶会碎掉。切去多余的胶，有时候胶的边缘会卷曲，一定要切掉，否则会有气泡产生。膜和胶相贴的那一面一定不能用手碰，要用镊子夹住去放。胶不怕碰脏，膜怕脏！一般膜和胶贴合的那一面没气泡，后续结果就很少有气泡产生。胶不能放反了 𐟧튨ƒ𖤸能放反了，我是固定左侧上样，放入三明治夹的时候，上样侧在我的右手边置于三明治的黑色夹子上，这样不会转反。切膜的小技巧 ✂️ 转膜后切膜的时候一定要膜和胶贴在一起用剪子剪，否则膜很容易就干了。切完再取下膜封闭。如果膜干了在封闭的过程中会慢慢恢复过来，不用担心，最好等恢复过来再敷抗体。封闭过程 𐟥› 一般用5%脱脂牛奶封闭1小时就可以了。脱脂牛奶可以在转膜开始后配置，放摇匀机充分摇匀混匀，以免牛奶未充分溶解影响结果。快速封闭液 ⏱️ 我用的是快速封闭液，15分钟封闭。本来想重复利用，结果隔几天再用结果背景全黑，所以还是一次性用吧。希望这些小心得能帮到大家，科研路上大家一起加油！𐟒ꀀ

WB实验迷茫？看这篇就够！ 1⃣️ 如何避免胶跑得不漂亮？配胶：清洗玻璃板并检查是否漏气，避免胶凝固不均匀。倒胶时要充分混合并去除气泡。双蒸水或乙醇隔离时，缓慢加入，避免稀释分离胶。平衡：将配置好的胶放入点泳池，室温放置10分钟，待胶与电泳液温度一致再进行电泳。上样：拔出上样梳时要保持水平，避免上样孔倾斜。在样品两侧增加等体积的空白1x loading buffer孔，避免两侧样品条带扩宽。电泳：小电压能使胶的分子筛效应更好。电压越小，条带越漂亮。浓缩胶55V，分离胶75V电泳效果最佳，但时间长。 2⃣️ 电泳中常见现象： “︶” 条带呈笑脸状 “︵” 条带呈皱眉状条带拖尾纹理（纵向条纹）条带偏斜条带两边扩散 3⃣️ 如何降低WB背景？膜封闭不够：建议延长封闭时间，选择合适的封闭液。一抗稀释度不适宜：太高时选择最适宜的抗体稀释度。一抗孵育温度偏高：建议4℃过夜孵育。膜选择不当：NC膜的背景通常比PVDF膜低，但吸附力稍差。膜干燥或反复接触：实验过程中要保持膜的湿润，使用镊子夹取膜。曝光时间过长：可减少曝光时间。 4⃣️ 如何减少杂带？目的蛋白存在多个修饰位点。目的蛋白有其他剪切本。样本处理过程中目的蛋白发生降解（最常见）。上样量过高：适当减少上样量。 5⃣️ 如何解决无信号或信号弱的问题？目标蛋白未提取出来：选用合适的裂解液。目标蛋白表达低：增加上样量。转移不完全或过转移：适当调整转膜的时间和电流。抗体不能识别测试种属的相关蛋白。一抗孵育时间不足：建议4℃结合过夜。二抗与一抗不匹配：选择针对一抗来源的种属的抗体。洗膜过度：缩短洗膜时间。 6⃣️ 其它现象：膜上多处出现黑点或黑斑：抗体与封闭试剂发生非特异性结合，或奶粉未充分溶解粘在膜上。反白（条带显白色）：目的蛋白含量太高或一抗浓度偏高。蛋白分子量偏低或偏高：胶浓度不适合，高分子量要用低浓度胶；小分子蛋白要用高浓度胶。

WB实验全攻略：12个关键步骤详解 1. 𐟧𜠥ꌥ‡†备：确保所有用于提取蛋白的耗材和实验所需物品都已清洗干净。电泳玻璃板应放在置物架上隔开，以避免长期放置后黏连。 𐟒砦Š𝦏蛋白：在整个过程中，抽提蛋白的操作应在冰上进行。裂解液加入后，细胞会被破坏，细胞内的酶会被释放。不在冰上操作会导致蛋白降解。一旦开始抽提，应一次性操作至加入loading Buffer煮蛋白变性。变性后的蛋白不易降解，可以长期保存于-80℃。 𐟧꠩…胶：确保所有配胶所需的试剂都在有效期内。配制分离胶和浓缩胶时，需快速颠倒混合均匀。分离胶需要用去离子水压一下，以去除气泡和压平液面。分离胶凝固后再配浓缩胶，插入孔梳时要快，浓缩胶的凝固时间比分离胶短。为了避免浓缩胶插梳子时有气泡，可以先将浓缩胶倒满，斜着插入，记得梳子的正反一定要放对，否则玻璃板会碎。 𐟔堧…𗯼š蛋白加上loading Buffer后一定要充分混匀，再去煮使蛋白变性。 𐟓 上样：为了美观，需要定量上样。根据BSA与BCA试剂AB现配现用，静置5分钟后检测，计算出每个样本的浓度，定量上样量计算每孔上样量。 ⚡ 电泳：浓缩胶80v30分钟，分离胶120v55分钟（分离胶的时间根据样本跑到图中这条线停止）。 𐟓‘ 转膜：不要直接用手接触膜与滤纸，手上油脂会对其造成污染。佩戴干净手套全程尽量用镊子夹取，避免每一层之间的气泡，让胶与膜之间美美贴合。三层我用的是滤纸，如果有气泡产生一定要拿平的板赶一下气泡。 ❄️ 温度：转膜液现配现用，等需转膜用时再从4℃冰箱中拿出用。一般会在盒子里放上2冰袋，盖上盒子之后再用冰袋和冰块覆盖严实。 𐟕’ 浸泡：封闭液需要充分溶解，不充分溶解会导致曝光时背景脏或一片漆黑。浸泡时间要足够，我一般用震荡机溶解配好的封闭液，浸泡1小时（根据抗体情况可适当延长封闭时间）。膜先在甲醇中浸泡30秒，再在转膜液中浸泡一分钟。 𐟦 抗体孵育：一抗和二抗购买哪家的抗体可在官网找到稀释比例，一般范围值内的我选用最大的稀释倍数。一抗4℃孵育过夜，二抗孵育时间90分钟。 𐟚🠦𔗨†œ：洗膜一定要洗干净，一抗洗3次，每次10分钟；二抗洗4次，每次10分钟。 𐟓𘠦›光：发光液现配现用，时间过长会引起发光效果不好，背景脏或一片漆黑。发光液及拍摄都需避光。

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