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转录因子背景权威发布_转录因子背景分析(2024年12月精准访谈)

内容来源：蜂巢动画所属栏目：观点更新日期：2024-12-04

转录因子背景

DAP-seq常见问题解答，一文搞定！ 1. 𐟔 DAP-seq技术原理与流程技术原理：DAP-seq通过体外表达蛋白与DNA进行亲和纯化，洗脱后进行高通量测序，从而找到转录因子的结合位点。技术流程：构建含有亲和标签的载体，体外表达转录因子与亲和标签的融合蛋白，提取基因组DNA并构建DNA文库。将体外表达的转录因子与DNA文库结合，洗脱后上机测序。解决的问题：快速定位转录因子的结合位点，发现转录因子调控的靶基因。 𐟓š 所需材料组织材料或提取好的基因组DNA 目标蛋白质粒（含有完整目标蛋白序列的质粒，如转录因子） 𐟓ˆ 实验成功率不同转录因子家族的成功率有所不同，具体成功率可参考相关资料。 𐟔„ 重复次数实验包含两个技术重复，以确保结果的可靠性。 𐟌𑠦䍧‰駻„织样本要求植物组织样本的取样时期和部位根据研究需求确定，不同组织和时期DNA的修饰可能影响蛋白与DNA的结合。 𐟔전AP-seq与ChIP-seq的区别 DAP-seq不需要针对每个转录因子制备特异性抗体，具有快速、高通量和节约时间成本的优势。 𐟓Š Input对照 Input对照用于降低背景噪音，是亲和纯化前的文库。 𐟓Œ Peak数目少的结果可用吗？虽然DAP-seq的peak数目较少，但建议仍然对现有结果进行分析，可能挖掘出亮点结果。 𐟔젩ꌨAP-seq结果 DAP-seq结果一般需要验证，验证手段包括EMSA、酵母单杂等实验。如果通过前期大量转录因子筛选出候选转录因子，也可以考虑体内ChIP等验证。

简介真核生物的转录是一个复杂的过程，涉及多种蛋白质和RNA分子的相互作用。X射线衍射技术在解析这些分子复合体的三维结构方面发挥了重要作用，极大地推动了真核转录机制的研究。通过揭示转录因子、RNA聚合酶和其他相关蛋白的结构，科学家们深入了解了真核转录的分子基础。 X射线衍射技术 X射线衍射是一种用于确定晶体结构的强大工具。其基本原理是通过X射线照射晶体样品，产生衍射图案，并通过解析这些图案来推导分子的三维结构。以下是X射线衍射技术在真核转录研究中的应用步骤：样品制备制备高质量的晶体是X射线衍射成功的关键。由于转录复合体通常是大型、多亚基的蛋白质复合物，结晶较为困难。科学家们通过优化结晶条件和使用特殊的添加剂，成功获得了多种转录相关蛋白和复合物的晶体。数据采集使用同步辐射光源进行数据采集。同步辐射光源具有高亮度和高稳定性，能够产生高分辨率的衍射数据。通过多角度、多波长的数据采集，可以获得完整的衍射图案。数据处理对衍射数据进行处理，去除噪声和背景信号。使用专业软件对衍射图案进行解析，确定分子的晶格参数、对称性和空间群。通过傅里叶变换将衍射数据转换为电子密度图，从而构建分子的三维结构模型。真核转录的关键复合体 RNA聚合酶II RNA聚合酶II（Pol II）是真核转录的核心酶，负责合成mRNA。利用X射线衍射技术，科学家们解析了Pol II的三维结构，揭示了其多个功能域和亚基的排列方式。这一结构为理解Pol II的催化机制和转录起始、延伸及终止过程提供了分子基础。转录因子转录因子是调控基因表达的重要蛋白，通过结合特定的DNA序列来启动或抑制转录。X射线衍射技术帮助科学家们解析了多个转录因子的结构，如TBP（TATA盒结合蛋白）和TFIIB等。这些结构揭示了转录因子如何识别DNA并与RNA聚合酶相互作用的分子机制。转录前起始复合体转录前起始复合体（PIC）由RNA聚合酶II和多种转录因子组成，负责在启动子区域组装并启动转录。利用X射线衍射技术，科学家们解析了PIC的高分辨率结构，揭示了各组分之间的相互作用和组装机制。这一结构为理解转录起始提供了重要的分子基础。重要发现和研究进展转录起始机制通过解析转录前起始复合体的结构，科学家们揭示了转录起始的分子机制。特别是，RNA聚合酶II如何与启动子DNA结合、转录因子如何促进Pol II的招募和定位，以及启动子开裂和转录起始的过程。转录延伸和调控 X射线衍射技术还揭示了转录延伸过程中RNA聚合酶II与DNA和RNA的相互作用。科学家们发现了Pol II的结构变化及其在核苷酸添加和校对过程中的作用。此外，研究还揭示了多种转录调控因子如何通过结合Pol II或调控其活性来调节转录延伸。转录后加工在转录过程中，mRNA需要经历一系列加工步骤，包括加帽、剪接和加尾。X射线衍射技术帮助科学家们解析了参与这些过程的多种酶和复合物的结构，如加帽酶和剪接体等。这些结构为理解mRNA加工的分子机制提供了重要信息。应用前景基因调控研究解析真核转录复合体的结构，为理解基因调控的分子机制提供了重要基础。这对于研究基因表达的调控网络、揭示基因功能和疾病机制具有重要意义。药物设计结构生物学研究为开发靶向转录因子或RNA聚合酶的药物提供了新的思路。例如，设计能够特异性抑制RNA聚合酶活性或阻断转录因子-DNA相互作用的药物，有望用于治疗癌症和其他与基因表达异常相关的疾病。合成生物学通过了解真核转录的分子机制，科学家们可以设计和构建新的转录调控元件，用于合成生物学和基因工程应用。例如，开发能够精确控制基因表达的人工转录因子和开关，推动生物技术和生物医学的进步。结论利用X射线衍射技术，科学家们成功解析了多种真核转录相关蛋白和复合物的结构，揭示了真核转录的分子基础。这一系列研究极大地推动了对基因表达调控机制的理解，为基因调控、药物设计和合成生物学等领域的研究提供了重要的理论基础。随着技术的不断进步，X射线衍射技术将在揭示复杂生物分子结构和功能中继续发挥重要作用。

如何写出高水平论文？这些要点你必须知道！写一篇高水平论文可不是一件容易的事，但也不是不可能。一般来说，一篇高质量的论文需要具备以下几个特点：假说要有创新性 𐟚€ 首先，你的假说必须要有新意，有创造性，而且要有较大的理论或实际应用价值。简单来说，你的研究要能解决某个科学问题，或者能提出一个新的观点。证据要充分且严谨 𐟔 支持你假说的证据必须充分且严谨。这意味着你需要提供多种来源的实验数据来支持你的结论。比如，要证明某个基因与癌症的关系，你可以用体外细胞实验、动物模型实验和人体临床数据来支持你的假说。数据解释要合理，结论要清晰 𐟓Š 你的数据解释要合理，结论要清晰。论文的写作要让复杂的东西变得简单易懂。如果你的论文写得让人一头雾水，那可能就有点低水平了。写作技巧 ✍️ 好的SCI文章不仅内容丰富，写作也要让复杂的东西变得易懂。你可以从以下几方面着手：多种证据支持：尽可能提供多种实验方法来论证你的假说。比如，可以用免疫组化的方法在蛋白质水平显示细胞内表达的分布情况，也可以用定量逆转录PCR的方法在mRNA水平检测基因的表达。直接证据：要取得直接证据，可以用ChIP实验来证实转录因子蛋白可直接与下游基因的启动子结合，从而上调下游基因的表达。完整的故事：发表高水平论文，单做一两个实验是不够的，需要做一系列的实验来把你的论据和论证串通起来，形成一个完整而严谨的科学故事。讨论部分要合理 𐟤” 在讨论部分，如何合理地解释数据结果也非常重要。经常发高水平论文的人其实也是原始数据解释的高手。有些人有好数据，却因为没有合理的解释好，所得出的结论不够清楚，导致论文档次下降。写作建议 𐟓– 分析文献：看看是否能从文献中得到启发。请同行审阅：请经验丰富的同行认真阅读你的论文，提出建议，弥补你想不到的地方。让非专业人士也能看懂：写专业性很强的科技论文，能被学科背景不是太强的半外行容易看懂很重要。如果有两个或以上的审稿人都误解了你的论文，那一定是你写作有问题。可以在写完之后给英文不错但专业背景不深的朋友阅读，如果她们能理解，说明这篇文章就把事情说清楚了。总之，写一篇高水平论文需要付出很多努力和汗水，但只要你用心去做，还是有可能的。加油吧！𐟒ꀀ

卡罗林斯卡医学院岗位制PhD二面经历分享上周，我有幸参加了卡罗林斯卡医学院岗位制PhD的二面，这也是终面，从众多候选人中脱颖而出。整个面试过程非常丰富，让我对研究和工作有了更深的了解。面试流程𐟓 这次面试与之前的一面有些不同，一面是与老师单独交流，大约半小时，提问也是半小时。而这次二面则是五个学生和老师一起对我进行面试，时间分配上，我先用半小时介绍了我的硕士毕业论文，然后老师和学生依次提问，也是半小时。老师提问𐟑颀𐟏늤𘻨恨𔡧Œš你在这项研究中的主要贡献是什么？其他合作者在研究中的贡献是什么？合作模式是怎样的？药物筛选：文章最后提到了药物筛选，用了什么方法？有没有考虑药物和靶点之间的蛋白质结构关系？用了什么方法验证？未来计划：文章还有什么需要补充的地方？计划什么时候发表？神经元通讯：如果计算的神经元特异性细胞通讯水平与一般的细胞通讯有很大的区别，那区别在什么地方？数学背景：数学或计算背景对你的生物信息研究有什么帮助？学生提问𐟑袀𐟎“ 模型选择：AD小鼠模型有很多，为什么选择5xFAD模型？有没有考虑与人类AD患者之间的关系？有没有尝试验证小鼠的结论能否迁移到人类中？星形胶质细胞：为什么没有发现星形胶质细胞？这会不会影响研究的严谨性？有没有后续补充实验？批次效应：去批次用了什么方法？有没有尝试其他方法？如何选择的这一方法？用了什么方法来判断是否过度去除批次效应？其他研究：除了这个项目之外还有没有其他研究经历？在这些研究过程中有怎样的收获？空间表观组学：在空间表观组学建模中使用了什么方法？如何构建的神经网络？课程学习：是否有系统的分子生物学与神经科学的课程学习经历？转录因子：如何整合ATAC和转录组构建TF驱动基因调控网络？是否利用湿实验验证这些转录因子的实际作用？ General Questions𐟤” 为什么选择卡罗林斯卡医学院以及为什么选择这个实验室？整个交流过程非常友好，问题也比较全面，基本上都是围绕我的研究项目展开。实验室成员包括一个中国博士后和一些来自欧洲和印度的成员，整体印象不错。不过，从提交申请到最终面试，时间跨度有点长，希望这次能有个好的结果。𐟙

从零开始：ChIP实验的详细指南（上） 𐟔 ChIP实验的原理和应用在活细胞中，蛋白质和DNA的结合是动态的。为了固定这种结合状态，我们使用甲醛来交联蛋白质和DNA。通过超声或酶切将染色质打断成小片段，然后用抗体特异性识别目标蛋白结合的DNA片段，最后对DNA片段进行纯化和检测（如qPCR、基因芯片、高通量测序等）。 ChIP实验广泛应用于研究转录因子与DNA的结合动态，以及组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。 𐟌 细胞固定内源状态下，蛋白质和DNA的结合是动态的，因此需要进行固定以捕获特定状态下的结合情况。最常用的固定试剂是甲醛。甲醛是一种小分子，能够穿透细胞膜和核膜，通过醛基将DNA和蛋白质交联在一起。甲醛交联是可逆的，通过加热可以解除交联，从而方便后续的DNA分析。但是，甲醛交联反应需要一定的时间，作用距离小于2ㅯ𜌥﹨›‹白表位也会有影响。过长时间和过短时间的交联都不利于实验。因此，甲醛交联是ChIP实验的关键步骤。 𐟒ᠧ”𒩆›交联的小贴士细胞生长状态会影响基因表达网络，可能会影响所研究的TF与promoter的结合。因此，细胞长到75%-85%时最好，所需的细胞量为1～2X 107左右。在甲醛交联之前，细胞应尽可能少被人为处理。如果条件允许，直接将甲醛加入培养基中进行交联更好。务必使用有效期以内、正确避光保存的分析或分子生物学级别的甲醛。固定条件通常为室温（不要高于25℃）固定10-15 min。当DNA和靶点结合较弱时，可适当延长交联时间。进行预实验优化交联时间和温度。交联时间过长或温度过高会显著降低染色质超声破碎效率，且可能遮蔽ChIP抗体识别的表位。交联不足可能导致蛋白质和DNA解离。组织交联相比细胞更复杂，大的组织块交联之前切成1-3 mm3大小，建议在真空条件下交联，促进甲醛透过细胞，交联时间可延长至15 min。 𐟌쯸 细胞核抽提及裂解由于蛋白和DNA相互作用主要发生在细胞核内，因此去除胞浆蛋白可以减少背景信号并提高灵敏度。同时，分离的细胞核直接悬浮在剧烈的裂解缓冲液中，更有利于打开细胞核释放染色质。

基因编辑技术在iPSC领域的应用与挑战诱导性多能干细胞（iPSCs）是一种通过引入特定转录因子将成体细胞转化为多能干细胞的技术。这项技术由日本学者山中伸弥及其团队于2006年首次发现。他们利用载体将Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4四种转录因子基因导入小鼠成体细胞，使其转化为类似胚胎干细胞（ESCs）的多能干细胞。次年，这项技术成功应用于人体细胞。为了提高iPSC的应用安全性，研究人员不断优化诱导方法。例如，使用质粒载体转染、腺病毒感染，以及无外源基因整合风险的合成RNAs和蛋白质方法。这些改进大大降低了因外源基因整合带来的安全隐患，使iPSC的应用前景更加广阔。 iPSCs与ESCs拥有相似的再生能力，理论上可以分化为成体的所有器官、组织或细胞，在很大程度上解决了神经、心肌等细胞难获取的问题。相比ESC，iPSC来源广取材方便，且不用破坏胚胎，不存在伦理道德的争议。不仅如此，患者自身来源的iPSC还可以规避细胞移植出现排异反应风险，因此iPSC在一定程度上冲击了ESC的地位，被认为在再生医学、新药开发、疾病模型构建等方面有更广泛的应用前景。尽管iPSC在疾病模型构建方面有巨大潜力，但其应用也面临挑战。一个主要问题是难以区分疾病表型是由目标基因突变引起的，还是由个体间遗传背景和环境差异导致的。为了克服这一难题，研究人员将基因编辑技术与iPSC结合，创建基因背景相同的同型对照，从而排除非点突变因素的干扰。具体方法包括：对患者来源的iPSC进行突变修复，观察分化后疾病表型是否消失；对正常人来源的iPSC进行特定基因的突变，观察分化后是否出现疾病表型。

AlphaFold3助力精准筛选转录因子高通量筛选技术（HTS），也被称为大规模集群式筛选，是一种结合了基因科学、蛋白质科学、分子药理学、细胞药理学和微电子技术等多学科的新型高新技术。它通过活性测试和筛选天然或合成化合物，具有快速、高效、经济和高特异性等优点。转录因子（TF），也称为反式作用因子，在基因表达调控中起着核心作用。为了深入理解其功能和分子调控机制，需要通过精准的高通量筛选技术来筛选目标转录因子。以下是具体的步骤： 𐟓Š 数据准备转录因子数据库构建：整理并收集目标物种的转录因子氨基酸序列，建立完整的数据库。目标序列选择：提供研究中功能基因的启动子序列，为后续分析和实验做准备。 𐟎蠤𘉧𛴥𛺦衊核酸建模（3DNA）：使用3DNA工具对目标核酸序列进行精确的三维建模，确保结构的准确性和可靠性。蛋白质建模（Swiss-Model）：利用Swiss-Model对转录因子序列进行同源建模，生成高质量的三维结构模型。 𐟔 粗筛 HDock：结合已有的PDB同源复合物信息，采用自由对接的混合策略，弥补模板误导问题，提高对接的准确性和可靠性。 HDock 预测结合亲和力，挑选结合能绝对值最高的前10个候选进入下一轮精准对接。 𐟔젧𒾥‡†筛选 AlphaFold-3：利用基于扩散的架构提升对复杂生物分子结构的预测精度，其预测结果接近实验解析水平，并提供预测置信度评估功能，量化结果的可靠性。 AlphaFold-3 对HDock 筛选出来的预测候选者进行一对一精准对接，获取PTM值及iPTM值。常见问题解答 HDock分值高，AF3中ipTM+pTM的分值就一定高么？答：不一定。虽然这两种评分系统都用于评估蛋白质结构模型的质量，但它们的计算方法和侧重点不同，因此结果可能不会完全一致。 HDock 分值和AF3中的ipTM + pTM分值都高于阳性对照，具体分子生物实验的可能性有多大？答：这增加了相互作用在分子生物实验中成功验证的可能性，但实验设计的精确性和生物学背景的考量是不可或缺的。实验验证仍然是确认任何生物学相互作用的金标准。

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